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培養(yǎng)細(xì)胞染色體顯示法

更新時(shí)間:2016-03-16  |  點(diǎn)擊率:1782

1、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入),準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時(shí))。
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min411100rpm20min4
4、提取上清夜,樣品制備完成。
蛋白質(zhì)提取液:300ml
1
、1Mtris-HClPH8 45ml
2
、甘油(Glycerol75ml
3
、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE,垂直板電泳!

2、植物組織蛋白質(zhì)提取方法 
三氯醋酸丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20的條件下保存12小時(shí),然后離心(48000rpm以上1小時(shí))棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%β-巰基乙醇),搖勻后離心(48000rpm以上1小時(shí)),然后真空干燥沉淀,備用。
4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(158000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)),可臨時(shí)保存在4待用。
5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80備用。
藥品:
提取液:含10%TCA0.07%β-巰基乙醇的丙酮
裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1MDTT65ul/ml。
這種方法針對(duì)雙向電泳,雜質(zhì)少,離子濃度小的特點(diǎn)!當(dāng)然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會(huì)減少!

3、組織:腸黏膜 
目的:WESTERN BLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟:
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇:(1.5ml1mlTRIPURE用量)
倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min
離心:12000 g10min,4度,棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml1mlTRIPURE用量)
振蕩,置室溫20min
離心: 7500g5 min,4度,棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2
沉淀中加入100%乙醇 2ml
充分振蕩混勻,置室溫20 min
離心: 7500g,5min,4度,棄上清吹干沉淀
1SDS溶解沉淀
離心:10000g,10min,4
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT
存在的問題:加入1SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結(jié)晶?測(cè)濃度,含量才1mg/ml左右。
解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮510分鐘,效果很好的。

4、植物材料:水稻苗,葉鞘,根
1200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysis buffer
urea   np-40  ampholine 2-me  pvp-40

5、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進(jìn)行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% Trichloroacetic acid(丙酮配制,含10mM0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20沉淀1小時(shí),4,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(10 mMβ-巰基乙醇),再于-20沉淀1小時(shí),同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可調(diào)) UKS[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇)2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10)6% Triton X-100],37溫育30min,期間攪動(dòng)幾次,28 (溫度低,高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好!上清即可上樣電泳。或者-70度保存

6、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
(1) sample, 液氮研磨
(2) 1.5 ml centrifuge tube
(3)
1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4
, 10-15minite
(5)
取上層液,蛋白質(zhì)就在里面 

 

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