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RNA評(píng)價(jià)與鑒定

更新時(shí)間:2010-01-26  |  點(diǎn)擊率:8152

RNA評(píng)價(jià)與鑒定
提取得到RNA溶液后,我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè),以確
定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn),對(duì)其質(zhì)
量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整且無(wú)酶等抑制物殘
留;Northern blot實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高,對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘
留要求較低;RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高,但對(duì)酶反應(yīng)
抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法
純化RNA,以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果。
RNA得率檢測(cè)——分光光度計(jì)法
RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性,不同組織RNA的豐度和RNA提取的
難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來(lái)說(shuō),可通過(guò)分光
光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm處的吸光值來(lái)計(jì)算RNA的含量。RNA
溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液
渾濁度、雜質(zhì)(多肽、苯酚等)濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)
準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處,1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025(光
程為1cm),即OD260=1時(shí),樣品中RNA濃度為40μg/ml。通常分光
光度計(jì)OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的,因此RNA提
取結(jié)束后,要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍,再用分光光度計(jì)
檢測(cè)。按下面的公式計(jì)算總RNA濃度:
總RNA濃度(μg/ml)= OD260×稀釋倍數(shù)× 40μg/ml
RNA純度檢測(cè)——分光光度計(jì)法
通過(guò)OD260/280來(lái)檢測(cè)RNA純度,OD260/230作為參考值。
OD260/280在1.9-2.1之間,可以認(rèn)為RNA的純度較好;
OD260/280值小于1.8,則表明蛋白雜質(zhì)較多;
OD260/280值大于2.2,則表明RNA已經(jīng)降解;
OD260/230值小于2.0,則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙
醇?xì)埩簟?br />注意:如果用TE溶解或洗脫RNA,會(huì)使OD260/280值偏大。
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳:
我們可以通過(guò)RNA變性電泳,來(lái)鑒定RNA的完整性,但一般情況
下常規(guī)電泳檢測(cè)即可。
RNA變性電泳方法如下:
1、凝膠制備:1.2%瓊脂糖凝膠
2、上樣電泳
①電泳混合液的制備:
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37%甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μ l甲醛凝膠上樣緩沖液,混合后離心5秒
⑥將樣品加入點(diǎn)樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳至溴酚藍(lán)帶跑到電泳槽中央(20cm長(zhǎng)電
泳槽,95V電壓,1小時(shí)左右)。
rRNA占總RNA的80-85%,在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到
28S(23S)和18S(16S)rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩
倍,說(shuō)明RNA完整性較好。
常規(guī)電泳:
由于變性電泳操作步驟較為復(fù)雜,所以在要求不太嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)
中,RNA的檢測(cè)可以通過(guò)常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。一般1%
左右的凝膠就可以。按常規(guī)電泳配制好凝膠和電泳溶液,總RNA
在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致。

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