電話咨詢:
010-50973130
技術(shù)文章
當(dāng)前位置:首頁 > 技術(shù)文章 > ELISA KIT組成及試劑配制

ELISA KIT組成及試劑配制

更新時(shí)間:2009-11-30  |  點(diǎn)擊率:2720

ELISA KIT組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板:一塊96

2.       標(biāo)準(zhǔn)品凍干品2瓶,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,其濃度為1,600 pg/ml,將其稀釋為400 pg/ml后,再做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋),分別稀釋成400 pg/ml,200 pg/ml,100 pg/ml50 pg/ml,25 pg/ml12.5 pg/ml,6.25 pg/ml,樣品稀釋液直接作標(biāo)準(zhǔn)濃度0pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制200 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 400 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

3.        樣品稀釋液1×20ml

4.        檢測稀釋液A1×10ml。
5.        檢測稀釋液B1×10ml。
6.        檢測溶液A1×120μl1:100臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制100μl/,實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A990μl檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。
7.        檢測溶液B1×120μl/1:100臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8.        底物溶液1×10ml/瓶。
9.        濃洗滌液1×30ml/瓶,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10.    終止液1×10ml/2N H2SO4。
11.    覆膜5
12.    使用說明書:1 
自備物品
1.   酶標(biāo)儀建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱
2.   微量加液器及吸頭,EP
3.   蒸餾水或去離子水,全新濾紙
標(biāo)本的采集及保存
1.        血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.        血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.        其它生物標(biāo)本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.        樣本處理:血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋5,000倍。
注:以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,-20℃不應(yīng)超過1個月,-80℃不應(yīng)超過2個月;標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。 
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,各試劑均應(yīng)平衡至室溫試劑不能直接在37℃溶解;試劑或樣品稀釋時(shí),均需混勻,混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,如樣品濃度過高時(shí),應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1.        加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μl,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2.        棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。
3.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
4.        每孔加檢測溶液B工作液同檢測A工作液 100μl,酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
5.        溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
6.        依序每孔加底物溶液90μl,酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色30分鐘內(nèi),此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止。
7.       依序每孔加終止溶液50μl,終止反應(yīng),此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8.       用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度OD。在加終止液后立即進(jìn)行檢測。
 
1. 試劑準(zhǔn)備:所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染。
2.  加樣:加樣或加試劑時(shí),請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,酶結(jié)合物或底物時(shí),*個孔與后一個孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的預(yù)孵育"時(shí)間,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時(shí)間包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品好控制在10分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用多道移液器加樣。
3.   孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度。
4.   洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5.  試劑配制:Detection ADetection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,盡量不要微量配置如吸取檢測溶液A時(shí),一次不要小于10μl,以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6.  反應(yīng)時(shí)間的控制:加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化比如,每隔10分鐘),如顏色較深,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7.  底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
    建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計(jì)算時(shí)請后乘以稀釋倍數(shù)。
 
洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去不可觸及板壁或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體;在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復(fù)此過程數(shù)次。
2. 自動洗板:如果有自動洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
 
計(jì)算
 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)對數(shù)坐標(biāo)OD值為橫坐標(biāo)對數(shù)坐標(biāo),在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,如curve expert 1.3,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。 
◇     注意事項(xiàng):
收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本,儲存在4℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本,將標(biāo)本及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。標(biāo)本2-8℃可保存48小時(shí),-20℃可保存1個月。-70度可保存6個月。部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。
◇     液體類標(biāo)本:
標(biāo)本必須為液體,不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個標(biāo)本量收集體積=100ul×檢測種類。取材前須向銷售人員索要說明書。
◇     血清:
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇     血漿:
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,加入10v/v抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇     尿液、胸腹水、腦脊液:
用無菌管收集。離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。仔細(xì)收集上清。如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇     細(xì)胞培養(yǎng)上清:
測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBSPH7.2-7.4稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
◇     組織標(biāo)本:
切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/mlAprotinin抑肽酶。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右2000-3000轉(zhuǎn)/。仔細(xì)收集上清置于-20度或- 70度保存,如有必要,可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

聯(lián)