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solarbio質(zhì)粒提取試劑盒簡(jiǎn)介 說明

更新時(shí)間:2010-10-24  |  點(diǎn)擊率:8784

 

質(zhì)粒提取試劑盒簡(jiǎn)介
 
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。
 
質(zhì)粒提取原理及流程
較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種:堿裂解法、煮沸法和去污劑TritonSDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈,適用于較小的質(zhì)粒(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和,一般用于分離大質(zhì)粒(>15kb)。
 
堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法,其原理為:染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分子,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子;當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí),線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋自質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中,離心去除沉淀后,就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
 
目前,市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法,不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料,其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上,然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)??梢杂糜诿盖小?/span>PCR、測(cè)序、細(xì)菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
 
影響質(zhì)粒提取的因素
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān),如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細(xì)胞的裂解、質(zhì)粒拷貝數(shù)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附柱的吸附量等。
 
宿主菌種類
質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,多數(shù)情況下我們是從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的質(zhì)量。從宿主菌如DH5α*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA。HBl01和它的衍生菌株,如TG1JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖類,如果沒有*去除,將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性,影響質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量。另外,有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性,會(huì)降低DNA的得率。因此推薦使用DH5α*0來提取質(zhì)粒DNA
 
培養(yǎng)時(shí)間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落,接種到培養(yǎng)物中含有相關(guān)抗生素的液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。不應(yīng)超過16小時(shí),因?yàn)檫@時(shí)細(xì)胞開始裂解,使得質(zhì)粒的得率降低,也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異。
 
質(zhì)粒擴(kuò)增
氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,但對(duì)松弛型質(zhì)粒的復(fù)制沒有影響。因此,在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,從而抑制了染色體的復(fù)制,但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長(zhǎng),故質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制,這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量,又可降低細(xì)胞的數(shù)量,使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴(kuò)增的氯霉素濃度為170ug/ml 。
 
 
抗生素
在菌株的各生長(zhǎng)階段都應(yīng)加入抗生素篩選?,F(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不含有在細(xì)胞分裂時(shí)確保平均分配的par位點(diǎn),無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞。
 
幾種常用抗生素的濃度

抗生素
儲(chǔ)存濃度
保存條件
嚴(yán)緊型質(zhì)粒工作濃度
松弛型質(zhì)粒工作濃度
氨芐青霉素
50mg/ml(溶于水)
-20℃
20ug/ml
100ug/ml
羧芐青霉素
50mg/ml(溶于水)
-20℃
20ug/ml
100ug/ml
氯霉素
34mg/ml(溶于無水乙醇)
-20℃
34ug/ml
170ug/ml
卡那霉素
10mg/ml(溶于水)
-20℃
10ug/ml
50ug/ml
鏈霉素
10mg/ml(溶于水)
-20℃
10ug/ml
50ug/ml
四環(huán)素
5mg/ml(溶于無水乙醇)
-20℃
10ug/ml
50ug/ml

 
質(zhì)??截悢?shù)
質(zhì)粒拷貝數(shù)常用的定義是指生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的起始復(fù)制機(jī)制。按照復(fù)制性質(zhì),可以把質(zhì)粒分為兩類:一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒,當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí),質(zhì)粒也復(fù)制一次,每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1-2個(gè)質(zhì)粒,如F因子;另一類是松弛型質(zhì)粒,當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制,每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)粒,如ColEl質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型,分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān),某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型,而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
 
部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)

質(zhì)粒種類
拷貝數(shù)
起始復(fù)制子
類型
pUC18/19載體
500-700
pMB1
高拷貝
pBluescript載體
300-500
ColE1
高拷貝
pGEM-T載體
300-400
pMB1
高拷貝
pTZ載體
>1000
pMB1
高拷貝
pBR322載體
15-20
pMB1
低拷貝
pACYC及其衍生載體
10-122
p1
低拷貝
pSC101及其衍生載體
5
pSC101
低拷貝

 
菌液收集及裂解
    細(xì)菌收集可以通過離心來進(jìn)行,不同的質(zhì)粒拷貝數(shù),菌液量的需求不同,對(duì)于低拷貝的質(zhì)粒,要相應(yīng)增加菌液的量。菌液是在堿性環(huán)境下裂解的,由于不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄的差異,細(xì)胞的破壁程度不同,對(duì)于細(xì)胞壁較厚的宿主菌,首先要進(jìn)行破壁處理:
 
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理,堿裂解時(shí)就能有效破壁
革蘭氏陽(yáng)性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
 
菌液收集、重懸以及宿主菌細(xì)胞破壁后,細(xì)胞在含有RNase ANaOH/SDS(溶液P2)中裂解。SDS溶解細(xì)胞膜的磷脂和蛋白成分,使細(xì)胞的內(nèi)容物如染色體、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的裂解時(shí)間是質(zhì)粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時(shí)間,盡量縮短質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中。長(zhǎng)時(shí)間處在堿性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生不可恢復(fù)的變性。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快,而且不能被限制性內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液P3中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境,高鹽使得變性的蛋白、染色體DNA、細(xì)胞碎片和SDS都沉淀下來,而質(zhì)粒復(fù)性留在上清溶液中。溶液要*、混勻以確保沉淀*。為了防止染色體DNA污染質(zhì)粒DNA,要避免劇烈振蕩,以防止染色體DNA被打斷,造成對(duì)質(zhì)粒DNA的污染。因?yàn)槿旧wDNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件下,都可以與硅膠膜結(jié)合,在低鹽的條件下,用洗脫液都能從膜上洗脫下來。因此,在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。
 
質(zhì)粒DNA分離和純化
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、基因組和RNA的污染。
不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)于質(zhì)粒純度的要求不同,常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)如酶切、測(cè)序等普通純度的質(zhì)粒即可滿足實(shí)驗(yàn),而對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),要求質(zhì)粒的純度較高如高純度或無內(nèi)毒素??梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求。
 
純化方法
    用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式,提取的質(zhì)粒純度高、操作方便快捷,可選擇的試劑盒有兩種類型,即普通質(zhì)粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
 
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
參見基因組DNA提取
 
質(zhì)粒的保存
    溶解在洗脫液EB中的質(zhì)粒DNA,也可以貯存在TE緩沖液中用水溶解的質(zhì)粒只能短期保存,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性,質(zhì)粒在酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解,4短期保存或-20-70長(zhǎng)期保存,也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中,加等體積甘油,于-70保存
 
質(zhì)粒鑒定與評(píng)價(jià)
瓊脂糖電泳檢測(cè)
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí),理想狀況是只出現(xiàn)超螺旋—條帶,但在質(zhì)粒提取過程中,由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等原因,使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂,可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條帶,這三條帶電泳遷移率從快到慢,分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體即沒有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粘連在—起。如果加溶液P2后過度振蕩,會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶,這條帶泳動(dòng)得較慢,是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是,有時(shí)候提取的質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶,這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋超螺旋的圈數(shù)不同所致。但是,只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定后,只有單一條帶,就證明沒有基因組的污染。
 
酶切檢測(cè)
質(zhì)粒提取后,為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否,就要進(jìn)行酶切鑒定,通過與Marker對(duì)比,確定質(zhì)粒的分子量大小。
 
用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)
    濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為:OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,而使用去離子水,比值會(huì)偏低,因?yàn)?/span>pH值和離子濃度會(huì)影響光吸收值,但并不表示純度低。
 
質(zhì)粒小量提取試劑盒
 

目錄號(hào)
包裝
價(jià)格
產(chǎn)地
D1100-50
50
Solarbio
D1100-100
100
160
Solarbio

 
 
產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞,通過吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的特性提取質(zhì)粒DNA。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能、專一地吸附DNA,可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。從1-5ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中,可快速提取5-15μg純凈地高拷貝質(zhì)粒DNA,提取率達(dá)85-90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)試驗(yàn),包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑,操作安全。
 
 
產(chǎn)品包裝:

試劑盒組成
D1100-50
D1100-100
儲(chǔ)存條件
RNase A
150ul
300ul
-20
溶液Ⅰ
15ml
30ml
RT
溶液Ⅱ
15ml
30ml
RT
溶液Ⅲ
20ml
40ml
RT
漂洗液
15ml
15ml×2
RT
洗脫液
10ml
20ml
RT
吸附柱
50個(gè)
100個(gè)
RT
收集管
50個(gè)
100個(gè)
RT
說明書
1
1
RT

 
 
注意事項(xiàng):
1、溶液在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入),混勻,置于2-8℃保存。
2、*次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液(如向15ml的漂洗液中加入60ml的無水乙醇)。
3、使用前請(qǐng)先檢查溶液和溶液是否出現(xiàn)混濁,如有混濁現(xiàn)象,可在37℃水浴中加熱幾分鐘,待溶液恢復(fù)澄清后再使用。
4、溶液、溶液和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子,如非指明,所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。
5、如果是提取革蘭氏陽(yáng)性菌質(zhì)粒,必須在裂解細(xì)胞前破細(xì)胞壁,方法如下:收集適量菌體,加入250ul溶液,充分懸浮菌體,加入溶菌酶至終濃度為10-20mg/ml37處理30min左右。加入溶菌酶的濃度和處理時(shí)間可根據(jù)不同的菌株和具體試驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。
6、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul,體積過小會(huì)影響回收效率;洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響,若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍,pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

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